來源：印染在線
0前言
生物酶精練工藝作為節能降耗、無污染的印染清潔生產工藝[1],近年來受到國內外的普遍關注。它作用條件溫和,耗水量和排放廢水COD值低,對棉纖維損傷小,是目前公認的堿煮練的理想替代工藝,顯示出很好的應用前景。然而,酶精練工藝對棉織物中的非纖維素雜質,如蠟質和果膠質,尤其是棉籽殼的去除效果較差,限制了其工業化應用[2,3]。
木聚糖是植物半纖維素的主要成分,為自然界中廣泛存在、含量僅次于纖維素的可再生多糖資源,占細胞干重的7%~35%[4]。木聚糖酶是一類可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的復合酶系。它以內切方式降解木聚糖主鏈架的β-1,4-木糖苷鍵,其水解產物主要是木二糖和木寡糖,少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶對棉籽殼的主要組分半纖維素有專一的降解作用。因此,提高木聚糖酶對棉籽殼的降解作用,能夠最大程度地提高復合酶對棉籽殼的降解效果。
酶活是衡量酶生物活性的重要指標,但目前尚無木聚糖酶酶活測定的標準方法。常用的DNS(3,5-二硝基水楊酸)法[5],采用比色法測定還原糖的生成量,從而獲得木聚糖酶的活力[6]。木聚糖酶水解木聚糖底物生成的還原性糖,可在煮沸條件下與DNS顯色劑生成棕紅色的氨基化合物。在一定范圍內,還原糖的生成量與反應液的顏色強度成正比。該法操作簡便,顯色穩定,重現性好,且無需特殊的儀器設備,是眾多科研單位公認的木聚糖酶檢測方法[7-10]。
1試驗
1.1儀器設備
電子天平(精度0.000 1g),pH計,可見分光光度計,恒溫振蕩水浴鍋,秒表,刻度試管,移液管,容量瓶,燒杯。
1.2材料
木聚糖(Sigma公司),D(+)-木糖(國藥集團化學試劑有限公司),木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶(諾維信公司),3,5-二硝基水楊酸(DNS),酒石酸鉀鈉,苯酚,偏重亞硫酸鈉,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鉀,醋酸,醋酸鈉,氫氧化鈉,十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉、平平加O、EDTA、JFC、陽離子助劑、硫酸鋁、硫酸亞鐵、硫酸錳。
1.3試劑與溶液的配制
(1)DNS試劑
取3,5-二硝基水楊酸7.5 g,充分溶解于500 mL蒸餾水(蒸餾水先沸煮10 min后,冷卻近室溫)中,逐步加入14 gNaOH。隨后,分別依次加入216 g酒石酸鉀鈉,5.5 mL苯酚(50℃水浴溶解),6 g偏重亞硫酸鈉(溶解過程中可加入適量蒸餾水)。待其充分溶解后,定容至1 000 mL,放入棕色瓶中靜置1~5 d,待用。溶液每月配制一次,平時使用時可倒少量于小瓶中,其余放入冰箱中靜置。
(2)0.25 g/LD(+)-木糖
用電子天平準確稱取0.025 g木糖,充分溶解后,定容至100 mL。
(3)pH值緩沖溶液
分別取不同量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀,用pH計配制pH值為5,6,7和8.8的緩沖溶液。同理,pH值為4的緩沖液采用醋酸緩沖液配制,pH值為10的緩沖液采用堿性緩沖液配制。
(4)木聚糖底物
采用相應的pH緩沖液配制。
1.4DNS法酶活測定
1.4.1D-(+)-木糖標準曲線的繪制
在刻度試管中加入2.0、2.5、3.0、3.5、4.5和5.5 mL的0.25 g/LD-木糖溶液,再分別加入DNS試劑5.0 mL,加蒸餾水分別定容至12 mL。加熱至沸,保持8 min,充分顯色,冷卻后定容至25 mL。在另一容量瓶中加入5.0 mL DNS試劑,定容至25 mL,作為參比溶液。在540 nm處,測定各溶液的吸光度,并以D-木糖質量濃度C為橫坐標,以吸光度A為縱坐標,繪制標準曲線。
A=m・C+n(1)
式中:A―――溶液吸光度
m―――繪制的標準曲線的斜率
C―――D-木糖質量濃度
n―――繪制的標準曲線的截距
1.4.2木聚糖酶酶活測定
試驗中,1 mL酶在一定溫度和pH值條件下,1 h分解木聚糖產生1mgD(+)-木糖,視為一個酶活力單位U。
取1 mL經稀釋的酶液,加入5 mL緩沖溶液,沸煮10 min(滅活木聚糖酶)后加入底物木聚糖溶液。處理一定時間后,加入DNS顯色8 min,得到參比液。另取木聚糖溶液1 mL于刻度試管中,加入不同pH值的緩沖溶液5 mL,在一定溫度的水浴中平衡5 min。加入稀釋后的木聚糖酶溶液1 mL,搖勻并開始計時。酶處理t時間后,迅速加入DNS試劑5 mL,并將刻度試管放入沸水浴中顯色8 min,冷卻,定容至25 mL。以參比液為空白,采用分光光度計在540 nm下測定溶液吸光度。如果吸光度過大,可以進行適當稀釋后測試。按式(3)計算酶活。
C=(A-n)/m(2)
U=(C×0.025 L)/(t×1 mL)(3)
式中:C―――生成木糖的質量濃度(mg/L)
A―――溶液吸光度
U―――木聚糖酶酶活
0.025 L―――顯色后定容體積
t―――酶反應時間(h)
1 mL―――木聚糖酶體積
2結果與分析
2.1酶稀釋倍數的影響
將1 mL木聚糖酶分別以蒸餾水稀釋100~10 000倍,并于緩沖溶液pH值8、反應溫度60℃、反應時間30 min條件下測定酶活,見圖1。
理論上,酶的活力與其稀釋倍數無關,即不同稀釋倍數下測得的酶活為定值[11]。但圖1中,酶的稀釋倍數不同,測得的酶活也不相同。這可能是由于底物木聚糖的濃度與酶的濃度不適應引起的。由于木聚糖的濃度相對很低,酶的稀釋倍數在10 000以內時,酶的濃度仍然相對太大,底物木聚糖可全部被水解。這種情況下,酶的稀釋倍數越大,酶活越高。但需要強調的是,稀釋倍數很大,會導致較大的滴定誤差。所以,本試驗中稀釋10 000倍后不再繼續稀釋。
2.2底物用量的影響
取1、2、3、4、5和6 mL 10.00 g/L木聚糖溶液于6個刻度試管中,然后依次向各試管中加入5、4、3、2、1和0 mL pH值為8的緩沖溶液。在60℃水浴中平衡5 min,加入稀釋5 000倍和10 000倍的木聚糖酶溶液1 mL,反應30 min,其余操作參照酶活測定方法。結果如圖2所示。
由圖2可以看出,木聚糖酶酶活與底物用量呈線性關系,底物用量越多,酶活越大。加入同量的木聚糖底物,酶溶液稀釋10 000倍時所測得酶活比稀釋5 000倍高一倍。但是,由于底物本身并非為澄清溶液,底物用量增加會影響其吸光度的測量。因此,底物的加入量不宜過多。
2.3木聚糖酶處理時間
取10 g/L木聚糖2 mL(酶稀釋10 000倍和5 000倍)或4 mL(酶稀釋10 000倍),水浴溫度60℃,緩沖溶液pH值8,酶處理時間2~40 min。測試不同處理時間下的木糖生成量和酶活,結果見圖3和圖4。
從圖3可以看出,木聚糖酶處理時間越短,計算得到的酶活越大。酶稀釋10 000倍、木聚糖加入量為2 mL時,酶處理2min,酶活計算值可達1.1×106;酶處理時間為5 min時,酶活計算值為1.7×105,變化明顯。酶處理時間為2~15 min,酶活計算值差異較大;酶處理時間超過15 min,酶活的計算值變化逐漸減小。在底物分解速率呈線性條件下選擇酶處理時間比較適宜。圖4中,酶處理時間0~20 min,木糖的生成速率大致在線性范圍內;酶處理時間為20~30 min,木糖濃度增加趨緩。綜上,選擇酶處理時間為20 min。
2.4木聚糖酶pH值
木聚糖酶用量1 mL(稀釋倍數5 000),5 g/L木聚糖1 mL,酶處理溫度60℃,酶處理時間20 min。調節酶溶液pH值為4、5、6、8、8.8和10,考察pH值對木聚糖酶酶活的影響,見圖5。
由圖5可以看出,木聚糖酶pH值為6時,其活性最高;pH值為5、7和8.8時,木聚糖酶也都保持較高的活力;pH為4和10時,木聚糖酶處理木聚糖的活力降低,說明酸性或堿性過強都會影響酶的活力。木聚糖酶較佳pH值為6。
2.5木聚糖酶最佳反應溫度
木聚糖酶用量1 mL(稀釋倍數5 000),5 g/L木聚糖1 mL,酶處理時間20 min,緩沖溶液pH值8。分別在溫度50、60、70、80和90℃下考察木聚糖酶的活力,見圖6。
由圖6可見,木聚糖酶的較佳反應溫度為60℃;處理溫度為50和70℃時,木聚糖酶也保持有較高的活力;但溫度為80和90℃時,酶的活力降低比較明顯。因此,木聚糖酶的處理溫度以50~70℃為佳。
2.6木聚糖酶恒溫穩定性
各取1 mL木聚糖酶液(稀釋5 000倍)于刻度試管中,分別加入5mL pH值為6的磷酸緩沖液和pH值為8(Na2CO3和自來水調節)的緩沖溶液,于60℃水浴中恒溫穩定1~6 h;隨后加入5 g/L木聚糖溶液1 mL,酶處理20 min,加入DNS顯色測定酶活。結果如圖7和圖8所示,以恒溫穩定0 h得到的酶活為100%。
由圖7可知,pH值為6時,木聚糖酶在60℃恒溫0~4 h,相對酶活都在85%以上,穩定性較好;恒溫保持6 h,相對酶活<70%,酶活下降明顯。
圖8中,pH值為8時,隨著恒溫時間的增加,木聚糖酶的相對酶活下降明顯,3~6 h內其相對酶活降至50%以下。因而,在紡織印染前處理應用中,需充分注意木聚糖酶的穩定時間,盡量在酶加入的1~2 h就予以使用。否則,木聚糖酶的活力會降低。
2.7其它前處理用酶制劑的影響
在紡織品生物酶處理中,根據前處理工藝的需要,常出現不同種類的酶劑共存的情況。這時,不同酶種對木聚糖酶活力的影響程度,將直接影響到酶種選擇及前處理效果。針對這一問題,選擇用于棉織物前處理的脂肪酶、纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等5種生物酶進行研究。結果見表1和表2。
由表1和表2可以看出,淀粉酶、果膠酶、纖維素酶、脂肪酶及其混合酶對木聚糖酶的活力沒有太大的影響。各混合酶的相對活力都在90%以上。因而,在印染前處理中,木聚糖酶與淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和脂肪酶都能共存。
2.8化學助劑的影響
生物酶前處理中,除了不同種類酶制劑相互混合外,還需加入滲透劑等表面活性劑。為了提高酶活力,減少原酶用量,研究了表面活性劑以及金屬離子對木聚糖酶活力的影響,結果見表3和表4。
由表3可知,陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉和十二烷基苯磺酸鈉對木聚糖酶的活力起抑制作用,可將相對酶活分別降低到33.58%和19.12%。非離子表面活性劑平平加O和JFC則對木聚糖酶的活力有很好的促進作用。另外,陽離子助劑對木聚糖酶的活力也有促進作用;EDTA會降低木聚糖酶的活力,但降低程度有限。
從表4可以看出,本試驗選取的金屬離子對木聚糖酶的活力均有抑制作用。亞鐵離子對木聚糖酶的活力影響最大,其次為錳離子,鋁離子的抑制作用較小。
2.9參比液的影響
采用DNS法測試木聚糖酶酶活的過程中,會根據木聚糖酶作用條件的變化選擇不同的參比液,雖然各參比液之間的差別并不是很明顯。為減少試驗中制作參比液的工作量,對木聚糖酶不同作用條件下參比液的吸光度進行比較。
制作參比液時,向1 mL滅活的木聚糖酶酶液(稀釋倍數5 000)中加入5 g/L緩沖液5 mL以及1 mL木聚糖底物,在一定溫度下反應20 min后,加入5 mLDNS試劑,沸煮8 min,使其充分顯色。選取不同類型的參比液,以蒸餾水作空白,測量其在540 nm波長下的吸光度,見表5和表6。
由表5和表6可以看出,不同pH值緩沖溶液、反應溫度參比液的吸光度均為0.03~0.04,在測量誤差范圍內,說明參比液沒有太大的影響。因而,在測定過程中,可以適當地用一個pH值的緩沖溶液、同一個反應溫度作為參比液,無需每個pH值和反應溫度都制備參比液。
3結論
(1)木聚糖酶的活力隨著酶稀釋倍數和底物木聚糖加入量的提高而增加,但二者不能無限增加,否則會引起測量誤差。本試驗最終選取酶的稀釋倍數為5 000,5 g/L底物木聚糖溶液用量1mL;酶處理反應時間20 min,pH值6,反應溫度60℃。
(2)木聚糖酶在pH=6磷酸緩沖體系60℃恒溫保持0~4 h,其相對酶活在85%以上,穩定性很好;時間超過6 h,酶活下降明顯。在pH=8(Na2CO3+自來水調節)條件下,3~6 h內,相對酶活會下降至50%以下,相對酶活下降明顯。
(3)淀粉酶、果膠酶、纖維素酶和脂肪酶等對木聚糖酶的活力影響均不明顯。
(4)對于木聚糖酶的活力,陰離子表面活性劑十二烷基磺酸鈉和十二烷基苯磺酸鈉起抑制作用;非離子表面活性劑平平加O、JFC則起到了很好的促進作用;陽離子助劑也有促進作用;EDTA起抑制作用,但效果不明顯。
(5)金屬離子中,亞鐵離子對木聚糖酶的酶活影響最大,錳離子次之,鋁離子的抑制作用較小。
(6)不同pH值緩沖溶液和不同反應溫度的參比液,其吸光度差別不大。因而,為減少操作量,試驗中,參比液可以選取同一種緩沖溶液和同一個反應溫度。
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